16886 0

Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в нео- и даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного лечения, диеты, переливания крови и т.д.

Однако такой подход не приводит к исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки.

Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную отсталость.

Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз.

Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов. Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания.

Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги, длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна.

Генная терапия

Генной терапией называется генетическая инженерия соматических клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К 80-м гг., когда были разработаны методы получения отдельных генов и созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах, перспективы генной коррекции стали реальными.

В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как следствие, иммунодефициту.

Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью.

Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.

Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а)

Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально функционирующих клеток в организм.

Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти подходы подробнее.

Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:
1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;
2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;
3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;
4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.

Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы. С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном используют две группы вирусов - аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов.

Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов

Рассмотрим устройство и использование конструкций на основе ретро-вирусов. Напомним, что геном ретровируса представлен двумя идентичными одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести участков: два длинных концевых повтора (LTR) на 5" и 3" концах, некодирующая последовательность *Р+, необходимая для упаковки РНК в вирусную частицу, и три участка, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), обратную транскриптазу (pol) и белок оболочки (env) (рис. 3.17, а).

Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а) и карта ретровирусного вектора (а)

Напомним, что жизненный цикл ретровируса включает следующие стадии:
1. Инфицирование клеток-мишени.
2. Синтез ДНК копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы.
3. Транспорт вирусной ДНК в ядро.
4. Встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
5. Транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного на участке 5"-LTR.
6. Трансляция белков Gag, Pol и Env.
7. Образование вирусного капсида и упаковки двух РНК-цепей и молекул обратной транскриптазы.
8. Высвобождение вирионов из клетки.

При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретро-вируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором (рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5"-LTR участке. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНК-вставки примерно 8 тыс. п.о.

Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая «пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться из-за отсутствия последовательности + (84*+) (рис. 3.18).

Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора

То есть оба эти фрагмента транскрибируются, но при этом образуются лишенные РНК пустые капсиды. При трансфекции РНК вирусного вектора в такие клетки она встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, и в таких условиях в капсидах упаковывается только РНК вектора (только в ней имеется +-последовательность). Образующиеся интактные вирусные частицы используют для эффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени.

Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток.

Трансдуцированные клетки тщательно проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способности клеток к росту или функционированию.

Наиболее пригодными для проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток -В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний, среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др.

Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пупoвинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени - гепатоциты - для лечения гиперхолестеролемии.

При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду.

Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса

Сконструированный таким образом вирус испытывали, распыляя его в нос и легкие экспериментальных животных, а затем людей-пациентов. В некоторых случаях наблюдалось введение и экспрессия здорового гена, и восстановление нормального переноса ионов хлора. Возможно, этот подход (введение нормального гена с помощью носовых аэрозолей) в ближайшем будущем будет широко использоваться для лечения симптомов кистозного фиброза в легких.

Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему - опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона).

Вирус простого герпеса I типа (HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на экспериментальных животных.

Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость, ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция. Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец, принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние, похожее на лейкемию.

Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ - это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход - это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1-3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты - терапевтические белки - поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови.

Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока, поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную доставку и проникновение в клетку.

В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем самым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию. Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени.

Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента, мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

Порядка двухсот миллионов жителей планеты являются потенциальными кандидатами для генной терапии, а несколько тысяч уже стали пациентами-пионерами и в рамках испытаний получили лечение от ранее неизлечимых заболеваний. Кандидат медицинских наук, врач-терапевт Лаборатории регенеративной медицины Медицинского центра МГУ, старший научный сотрудник Факультета фундаментальной медицины МГУ, победитель «Научных боев» Политеха - 2015 Павел Макаревич объяснил T&P, как работает генная терапия и с какими проблемами сталкиваются ученые, разрабатывая этот принципиально другой метод лечения многих серьезных болезней.

Павел Макаревич

200 миллионов потенциальных кандидатов - это очень много. До половины случаев, в которых помогает генная терапия, это наследственные заболевания: гемофилия, иммунодефициты, болезни накопления, энзимопатия, 25–30% случаев - это онкологические заболевания, оставшиеся 20% - все остальное: кардиология, неврология, болезни нервной системы и даже травмы, например повреждения нерва или другие, более тяжелые случаи. Такое распределение связано с тем, что наследственные заболевания протекают крайне тяжело и зачастую имеют летальный исход, и там нет другого лечения в принципе, за исключением генной терапии.

В качестве лечебного действующего вещества в генной терапии используется генетическая информация, а точнее молекулы, которые ее несут: нуклеиновые кислоты РНК (реже) и ДНК (чаще). В каждой клетке есть «ксерокс» - экспрессионный аппарат - механизм, с помощью которого клетка переводит генетическую информацию в белки, позволяющие ей правильно функционировать. То состояние, когда есть правильный ген и хорошо работающий «ксерокс» (который вообще-то должен работать всегда, иначе такая клетка нежизнеспособна), с точки зрения генной терапии можно условно назвать здоровьем клетки. В любой клетке есть полная библиотека этих оригиналов - генов, которые клетка использует для правильной экспрессии белков и нормального функционирования. При патологии возможны самые различные ситуации. Например, когда по какой-то причине потерян важный оригинал (ген) или большая его часть и восстановить такую потерю уже невозможно. В такой ситуации развиваются такие заболевания, как, например, миодистрофия Дюшенна, которая приводит к прогрессивному параличу всех мышц тела и заканчивается смертью в 25–27 лет - как правило, от остановки дыхания.

Другой пример - небольшая «поломка», не такая фатальная, но тем не менее приводящая к тому, что этот белок не работает - не выполняет своей биологической функции. И если это, например, VIII фактор свертывания крови, то у человека развивается гемофилия. В обеих этих ситуациях наша задача - доставить в ткань «нормальную», рабочую копию гена, то есть как бы подложить в этот «ксерокс» правильный оригинал, чтобы наладить работу клетки и, может быть, целого организма, продлевая таким образом ему жизнь. Работает ли это? Да, такие подходы эффективны в экспериментах на животных и уже проходят стадии клинических испытаний на пациентах, хотя следует признать, что трудностей на пути хватает.

Мы также разрабатываем подходы для лечения ишемических заболеваний, которые гораздо более распространены, чем наследственная патология, хотя, несомненно, для них существует и множество других способов лечения. Дело в том, что каждый человек, который болеет ишемической болезнью сердца или конечностей, рано или поздно оказывается в состоянии, когда единственным способом лечения для него может оказаться генная терапия.

С помощью генной терапии лечится большая группа заболеваний, связанных с поражением центральной нервной системы, - болезнь Паркинсона, Альцгеймер, боковой амиотрофический склероз. Существуют вирусы, которые имеют склонность атаковать центральную нервную систему, и это свойство можно использовать во благо. Например, вирус герпеса живет в нервах, и с его помощью в нервную систему можно доставлять факторы роста и цитокины, которые замедляют развитие этих заболеваний. Это как раз пример того, когда вирус, вызывающий заболевание, редактируется, лишается белков, отвечающих за его патогенное действие, и используется как кассета, а факторы роста защищают нейроны от гибели, которая происходит при этих заболеваниях и становится причиной гибели больного. Таким образом получается, что вирусы, несущие гены факторов роста, замедляют прогресс болезни и продлевают жизнь пациента.

Или, например, слепота - состояние, которое полностью лишает человека зрительных образов на всю жизнь. Одна из причин слепоты - так называемая врожденная атрофия Лебера, которая развивается из-за мутации в гене RPE 65. В мире сейчас уже около 80 людей обрели минимальные зрительные возможности благодаря генной терапии - модифицированному аденовирусу, который доставил «рабочий» RPE 65 в ткани глаза и повысил его чувствительность к свету.

Как мы доставляем генетическую информацию в ткани: локально, в конкретный орган, или сразу в весь организм? Есть два варианта. Первый - это плазмида, то есть кольцевая молекула ДНК. Она супер спирализуется, становится очень маленькой и компактной, и мы «упаковываем» ее в какой-нибудь химический полимер, чтобы облегчить ее проникновение в клетку. В чем здесь проблема? Плазмидная ДНК через 12–14 дней будет удалена из клетки, и продукция белка остановится. В такой ситуации мы можем предпринять два решения: первое - ввести дополнительную дозу плазмидной ДНК (благо она не иммуногенна), второе - ввести туда сразу несколько генов (например, для усиления эффектов цитокинов на регенерацию ткани), чтобы увеличить силу действия в тот короткий период времени, в течение которого будет идти продукция белков.

Другой выход (о нем мы уже упоминали выше) - это вирусы. Изначально вирусы - патогенные частицы, вызывающие заболевания, но в нашем случае они могут использоваться и для доставки генетической информации в клетки. С помощью методов генетической инженерии мы можем убрать у вируса белки, отвечающие за его патогенное действие, оставив ему лишь то, что необходимо для проникновения в клетку, и нагрузив нужной нам информацией. Тогда вирус из оружия превращается в кассету для доставки полезной, лечебной генетической информации.

Получается, что у нас есть два очень мощных способа доставки гена, и вирус явно выглядит более предпочтительным, потому что он сам может находить свои мишени в организме: например, вирус гепатита найдет печень, а вирус герпеса - нейроны. Плазмида, кольцевая ДНК, работает только там, куда ее ввели. Возникает вопрос: почему мы до сих пор вообще пользуемся плазмидами, если есть вирусы? Ответ такой: вирусы иммуногенны, они вызывают иммунный ответ. И, как вариант, они могут быть либо уничтожены иммунной системой до того, как успеют сработать, либо, как худший вариант, они могут вызывать побочные действия - мощные иммунные реакции на введение вируса. Получается очень хрупкий баланс между эффективностью и безопасностью, который определяет судьбу препаратов, которые мы разрабатываем, и, если препарат показал себя небезопасным на этапе разработки, это тупик.

Чтобы разработать, получить и протестировать новый препарат для генной терапии, лаборатория или даже целый институт должны работать несколько лет. Это, мягко говоря, недешево, пока это штучное производство, и протоколы, если они не спонсируются разработчиком, очень дорогие. Есть два или три препарата, зарегистрированных в Европе, один в Японии, в России пока только один - «Неоваскулген», препарат для стимуляции роста сосудов.

Препараты, которые используются для генной терапии, имеют не изученную ранее фармакокинетику, фармакодинамику. Вся проблема в том, что на данный момент об этом накоплено очень мало информации по сравнению с тем, сколько ее вокруг обычных препаратов. Это означает, что все риски, связанные с генной терапией, теоретически должны учитываться при разработках. Допустим, мы знаем, что не нужно испытывать тысячекратную дозу аспирина на практике, и мы этого не делаем. В отношении генной терапии, поскольку мы пока не знаем фармакокинетику (а значит, и многих особенностей действия препаратов), мы должны учитывать все существующие возможные эффекты, и это сильно растягивает исследование во времени.

Вторая проблема заключается в том, что каждый препарат имеет свой уникальный тип действия. Это означает, что нужно доказывать его безопасность и эффективность на уникальных моделях, а это тоже растягивает период, после которого можно сказать: «Да, лекарство может быть выведено в клинику или на рынок, и это безопасно». Поэтому я считаю, что это во многом вопрос времени и опыта человечества в этой области, который, как и в любом drug-девелопменте, будет накапливаться ценой больших проблем: остановленных исследований, побочных эффектов. Но я также знаю, что это вопрос затраченных усилий сотен исследователей и потенциальный способ помочь миллионам людей. В настоящее время уже накоплен опыт и извлечены некоторые уроки, которые помогают идти дальше.

Генотерапия - совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций.

Концепция генотерапии, появилась сразу после открытия явления трансформации у бактерийи изучения механизмов трансформации клеток животных опухолеобразующимивирусами. Такие вирусы могут осуществлять стабильное внедрение генетического материала вгеномклетки хозяина, поэтому было предложено использовать их в качествевекторовдля доставки желаемой генетической информации в геном клеток. Предполагалось, что такие векторы могут в случае необходимости поправлять дефекты генома.

Реальностью генная коррекция соматических клеток стала после 1980-х годов, когда были разработаны методы получения изолированных генов, созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали обычными переносы генов у мышей и других животных.

Исторически генная терапия нацеливалась на лечение наследственных генетических заболеваний, однако поле её применения, по крайней мере теоретически, расширилось. В настоящее время генную терапию рассматривают как потенциально универсальный подход к лечению широкого спектра заболеваний, начиная от наследственных, генетических и заканчивая инфекционными.

К генно-терапевтическим подходам теперь относят также и такие подходы, когда клетки модифицируют, чтобы усилить иммунный ответорганизма на нежелательные явления, вызванные инфекцией или возникновением опухолей. Модификация также осуществляется введением новой генетической информации либо в клетки, против которых хотят увеличить иммунный ответ, либо в клетки иммунной системы, с помощью которых хотят усилить этот эффект. Хотя строго говоря эта стратегия не совсем вписывается в классическое понятие генной терапии.

Главной проблемой является преодоление барьеров для проникновения терапевтического агента в опухоль с минимальной токсичностью для здоровых клеток. Модели дают очень обещающие результаты, однако даже с лучшими животными моделями остается проблема перехода к человеку, который отличается и биохимически и физиологически от модели.

3. Роль мелатонина в формировании суточной, сезонной ритмичности, и в адаптации к сезонным изменениям. Влияние мелатонина на репродуктивную функцию млекопитающих и на характер индивидуального развития. Основные этапы онтогенеза на которых изменяется продукция мелатонина, их значение.

Основные функции: Регулирует деятельность эндокринной системы, кровяное давление, периодичность сна, регулирует сезонную ритмику у многих животных, замедляет процессы старения, усиливает эффективность функционирования иммунной системы, обладает антиоксидантными свойствами, влияет на процессы адаптации при смене часовых поясов, кроме того, мелатонин участвует в регуляции, кровяного давления, функций пищеварительного тракта, работы клеток головного мозга.

Влияние на сезонную ритмику и размножение

Так как продукция мелатонина зависит от длины светового дня, многие животные используют ее как «сезонные часы». У людей, как и у животных, продукция мелатонина летом меньше, чем зимой. Таким образом, мелатонин может регулировать функции, зависящие от фотопериода - размножение, миграционное поведение, сезонную линьку. У видов птиц и млекопитающих, которые размножаются при длинном дне, мелатонин подавляет секрецию гонадотропинов и снижает уровень половой активности. У животных, размножающихся при коротком световом дне, мелатонин стимулирует половую активность. Влияние мелатонина на репродуктивную функцию у человека недостаточно изучено. В период полового созревания пиковая (ночная) концентрация мелатонина резко снижается. У женщин с гипофизарной аменореей концентрация мелатонина достоверно выше, чем у здоровых. Эти данные позволяют предполагать, что мелатонин подавляет репродуктивные функции у женщин.

Циркадный ритм и сон

Одним из основных действий мелатонина является регуляция сна. Мелатонин - основной компонент пейсмейкерной системы организма. Он принимает участие в создании циркадианного ритма: он непосредственно воздействует на клетки и изменяет уровень секреции другихгормонови биологически активных веществ, концентрация которых зависит от времени суток. Влияние светового цикла на ритм секреции мелатонина показано в наблюдении за слепыми. У большинства из них обнаружена ритмичная секреция гормона, но со свободно меняющимся периодом, отличающимся от суточного (25-часовой цикл по сравнению с 24-часовым суточным). То есть у человека ритм секреции мелатонина имеет вид циркадианной мелатониновой волны, «свободно бегущей» в отсутствие смены циклов свет-темнота. Сдвиг ритма секреции мелатонина происходит и при перелёте через часовые пояса.

Роль эпифиза и эпифизарного мелатонина в суточной и сезонной ритмике, режиме сна-бодрствования на сегодняшний день представляется несомненной. У диурнальных (дневных) животных (в том числе у человека) секреция мелатонина эпифизом совпадает с привычными часами сна. Проведенными исследованиями было доказано, что повышение уровня мелатонина не является обязательным сигналом к началу сна. У большинства испытуемых прием физиологических доз мелатонина вызывал лишь мягкий седативный эффект и снижал реактивность на обычные окружающие стимулы.

С возрастом активность эпифиза снижается, поэтому количество мелатонина уменьшается, сон становится поверхностным и беспокойным, возможна бессонница. Мелатонин способствует устранению бессонницы, предотвращает нарушение суточного режима организма ибиоритма.

Основное влияние мелатонина на эндокринную систему у многих видов заключается в торможении секреции гонадотропинов. Кроме того, снижается, но в меньшей степени, секреция других тропных гормонов передней долигипофиза-кортикотропина,тиротропина,соматотропина. Мелатонин снижает чувствительность клеток передней доли к гонадотропин-рилизинг фактору и может подавлять его секрецию.

Данные экспериментов свидетельствуют о том, что под влиянием мелатонина повышается содержание ГАМК- в ЦНС исеротонинавсреднем мозгеигипоталамусе. Известно, что ГАМК является тормозныммедиаторомв ЦНС, а снижение активности серотонинэргических механизмов может иметь значение впатогенезедепрессивных состояний.

Недостаток мелатонина в организме

Эксперименты на лабораторных животных показали, что при недостатке мелатонина, вызванном удалением рецепторов, животные начинали быстрее стареть: раньше начиналась менопауза, накапливались свободнорадикальные повреждения клеток, снижалась чувствительность кинсулину, развивалисьожирениеирак.

БИЛЕТ № 56

"

Генная терапия в широком смысле слова означает лечение путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых последовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассматривалась как возможность исправления дефекта в гене.

Дальнейшие исследования внесли коррективы в эти представления. Оказалось, что значительно проще исправлять не сам дефект в гене, а вести коррекцию путем введения в организм пациента полноценно работающего гена. Оказалось, что генная терапия должна осуществляться исключительно на соматических тканях, генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток весьма проблематична и мало реальна. Причина этого - реальная опасность засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесение мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества (Фр. Андерсон, Т. Каски, Фр. Коллинс и др.). Наконец, практическая методология генной терапии оказалась пригодной для лечения не только моногенных наследственных заболеваний, но и широко распространенных болезней, какими являются злокачественные опухоли, тяжелые формы вирусных инфекций, СПИД, сердечно-сосудистые и другие заболевания.

Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильт- рирующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы. При этом заболевании в крови пациентов накапливается в высокой концентрации 2-дезок- сиаденозин, оказывающий токсическое действие на Т- и В-лимфоциты, в результате чего развивается серьезный комбинированный иммунодефицит. 14 сентября 1990 года в Бетезде (США) 4-летней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100 000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном АДА (ген АДА + маркерный ген пео + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 мес. В течение 3 лет терапии в общей сложности было проведено 23 внутривенные трансфузии АДА-трансформированных лимфоцитов. В результате лечения состояние пациентки значительно улучшилось.

Другие моногенные наследственные заболевания, в отношении которых уже имеются официально разрешенные протоколы и начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолестеринемии (1992), гемофилии В (1992), муковисцидоза (1993), болезни Гоше (1993). К 1993 г. только в США к клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций было допущено 53 проекта. К 1995 г. в мире число таких проектов возросло до 100, и более 400 пациентов было непосредственно вовлечено в эти исследования . Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной терапии учитывают, что последствия манипулирования генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недостаточно. Поэтому при разработке программ генной терапии принципиальное значение имеют вопросы безопасности применения схем лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом.

Программа генной терапии для клинических испытаний включает следующие разделы: обоснование выбора нозологии для проведения курса генной терапии; определение типа клеток, подлежащих генетической модификации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающее опыты на культурах клеток и на модельных животных; разработку процедуры переноса ее в клетки пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные последствия и способы их предупреждения.

В Европе такие протоколы составляют и утверждают в соответствии с рекомендациями Европейской рабочей группы по переносу генов и генной терапии. Важнейшим элементом в программе генной терапии является анализ последствий проводимых процедур. Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительной персистен- ции его в этих клетках и создание условий для полноценной работы, то есть экспрессии. Залогом длительной персистенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном, то есть в ДНК-клетки хозяина. Основные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделяются на химические, физические и биологические. Конструирование векторов на базе вирусов представляет собой наиболее интересный и перспективный раздел генотерапии.

Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами, обеспечивающих адресную доставку новых блоков генетической информации в заданные участки генома, совершило революцию в биологии и медицине. В этом случае сам ген все чаще начинает выступать в качестве лекарства, применяемого для лечения различных заболеваний. Не за горами применение генотерапии и для борьбы с мультифакториальными заболеваниями. Уже сейчас на современном уровне наших знаний о геноме человека вполне возможны такие его модификации путем генной трансфекции, которые могут быть предприняты с целью улучшения ряда физических (например, рост), психических и интеллектуальных параметров. Таким образом, современная наука о человеке на своем новом витке развития вернулась к идее «улучшения человеческой породы», постулированной выдающимся английским генетиком Фр. Гальтоном и его учениками.

Генотерапия в XXI веке не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решать которые необходимо уже в ближайшем будущем.

За свою относительно недолгую историю генная терапия претерпела и « взлеты и падения» : иногда ученые и практические врачи видели в ней чуть ли не панацею, а затем наступал период разочарования и скептицизма…
Идеи о возможности введения в организм генов с терапевтической целью были высказаны еще в начале 60-х годов минувшего столетия, однако реальные шаги были сделаны лишь в конце 80-х и были тесно связаны с международным проектом по расшифровке генома человека.

В 1990 г. была предпринята попытка генной терапии тяжелого, зачастую несовместимого с жизнью, наследственного иммунодефицита, вызванного дефектом в гене, кодирующем синтез фермента аденозиндезаминазы. Авторы исследования сообщили о четко выраженном терапевтическом эффекте. И хотя со временем возник ряд сомнений по поводу стойкости полученного эффекта и его конкретных механизмов, именно эта работа послужила мощнейшим толчком для развития генной терапии и привлекла многомиллиардные инвестиции.

Генная терапия — медицинский подход, основанный на введении в клетки генных конструкций для лечения различных заболеваний. Желаемый эффект достигается либо в результате экспрессии введенного гена, либо за счет подавления функции дефектного гена. Следует подчеркнуть, что целью генной терапии является не « лечение» генов как таковых, а лечение различных заболеваний с их помощью.

Как правило, в качестве « лекарственного препарата» используют фрагмент ДНК, содержащий необходимый ген. Это может быть просто « голая ДНК» , обычно в комплексе с липидами, белками и др. Но гораздо чаще ДНК вводят в составе специальных генетических конструкций (векторов), созданных на основе разнообразных вирусов человека и животных с помощью целого ряда генно-инженерных манипуляций. Например, из вируса удаляют гены, необходимые для его размножения. Это, с одной стороны, делает вирусные частицы практически безопасными, с другой, « освобождает место» для генов, предназначенных для введения в организм.

Принципиальным моментом генной терапии является проникновение генной конструкции в клетку (трансфекция), в подавляющем большинстве случаев — в ее ядро. При этом важно, чтобы генная конструкция достигла именно тех клеток, которые нужно « лечить» . Поэтому успешность генной терапии во многом зависит от выбора оптимального или, по крайней мере, удовлетворительного способа введения генных конструкций в организм.

С вирусными векторами ситуация более или менее предсказуема: они распространяются по организму и проникают в клетки подобно своим вирусам-предкам, обеспечивая достаточно высокий уровень органной и тканевой специфичности. Такие конструкции обычно вводят внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно.

Для « целевой доставки» невирусных векторов был разработан ряд специальных методов. Простейший метод доставки нужного гена в клетки in vivo — прямая инъекция генетического материала в ткань. Использование данного метода ограничено: инъекции можно делать только в кожу, тимус, поперечно-полосатые мышцы, некоторые плотные опухоли.

Другой способ доставки трансгена — баллистическая трансфекция. Она основана на « обстреле» органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам), покрытых фрагментами ДНК. Для « обстрела» используют специальную « генную пушку» .

При лечении заболеваний легких возможно введение генетического материала в дыхательные пути в виде аэрозоля.

Трансфекцию клеток можно также проводить ех vivo: клетки выделяют из организма, производят с ними генно-инженерные манипуляции, а затем вводят обратно в организм больного.

Лечим: наследственное …

На начальном этапе развития генной терапии ее основными объектами считались наследственные заболевания, вызванные отсутствием или недостаточной функцией одного гена, то есть моногенные. Предполагалось, что введение больному нормально функционирующего гена приведет к излечению от болезни. Неоднократно предпринимались попытки лечения « королевской болезни» — гемофилии, миодистрофии Дюшена, муковисцидоза.

Сегодня разрабатываются и испытываются методы генной терапии почти 30 моногенных заболеваний человека. Между тем, вопросов остается больше, чем ответов, а реальный терапевтический эффект в большинстве случаев не достигнут. Причинами этого, прежде всего, являются иммунная реакция организма, постепенное « затухание» функций введенного гена, а также невозможность добиться « адресного» встраивания переносимого гена в хромосомную ДНК.

Моногенным заболеваниям посвящены менее 10% исследований генной терапии, остальные же касаются ненаследственных патологий.

…и приобретенное

Приобретенные заболевания не связаны с врожденным дефектом в структуре и функции генов. Их генная терапия основывается на положении, что введенный в организм « терапевтический ген» должен привести к синтезу белка, который либо окажет лечебное действие, либо будет способствовать увеличению индивидуальной чувствительности к действию лекарственных средств.

Генная терапия может быть использована для предотвращения тромбообразования, восстановления сосудистой системы сердечной мышцы после инфаркта миокарда, профилактики и лечения атеросклероза, а также в борьбе с ВИЧ-инфекцией и онкологическими заболеваниями. Например, интенсивно развивается такой метод генной терапии опухолей, как повышение чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам, проводят клинические испытания с участием пациентов с плевральной мезотелиомой, раком яичников, глиобластомой. В 1999 г. был одобрен протокол лечения рака предстательной железы, подобраны безопасные дозы химиопрепаратов и продемонстрирован положительный лечебный эффект.

Безопасность и этика

Проведение генетических манипуляций с организмом человека предъявляет особые требования к безопасности: ведь любое введение в клетки чужеродного генетического материала может иметь отрицательныеотрицательные последствия. Неконтролируемое встраивание « новых» генов в те или иные участки генома больного может привести к нарушению функции « своих» генов, что, в свою очередь, может вызвать нежелательные изменения в организме, в частности образование раковых опухолей.

Помимо этого, негативные генетические изменения могут возникнуть в соматических и половых клетках. В первом случае речь идет о судьбе одного человека, где риск, связанный с генетической коррекцией несравнимо меньший, чем риск смертельного исхода от имеющегося заболевания. При введении же генных конструкций в половые клетки нежелательные изменения в геноме могут быть переданы будущим поколениям. Поэтому совершенно естественным представляется стремление запретить эксперименты по генетической модификации половых клеток не только из медицинских, но и из этических соображений.

Ряд морально-этических проблем связан с разработкой подходов к генному вмешательству в клетки развивающегося эмбриона человека, то есть с внутриматочной генной терапией (терапией in utero). В США возможность использования генной терапии in utero рассматривается только для двух тяжелейших генетических заболеваний: тяжелого комбинированного иммунодефицита, вызванного дефектом в гене фермента аденозиндезаминазы, и гомозиготной бета-талассемии — тяжелого наследственного заболевания, связанного с отсутствием всех четырех глобиновых генов или мутациями в них. Уже разработан и готовится к предварительным испытаниям ряд генных конструкций, доставка которых в организм, как предполагается, приведет к компенсации генетических дефектов и устранению симптомов этих болезней. Однако риск возникновения отрицательных генетических последствий таких манипуляций достаточно велик. Поэтому этичность внутриматочной генной терапии также остается спорной.

В январе этого года в США опять были временно запрещены эксперименты по генной терапии. Причиной стали опасные осложнения, возникшие у двух детей после генной терапии наследственного иммунодефицита. Несколько месяцев назад во Франции у одного из детей, считавшихся излеченными благодаря генной терапии, был обнаружен лейкозоподобный синдром. Эксперты не исключают, что именно использование в ходе терапии векторов на основе ретровирусов может быть причиной развития осложнений у детей. Теперь представители Управления по контролю пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) будут рассматривать вопрос о продолжении экспериментов по генной терапии в индивидуальном порядке, причем лишь в том случае, если других способов лечения заболевания не существует.

Не панацея, но — перспектива

Нельзя отрицать, что реальные успехи генной терапии в лечении конкретных больных довольно скромны, а сам подход все еще находится на стадии накопления данных и разработки технологий. Генная терапия не стала и, очевидно, никогда не станет панацеей. Регуляторные системы организма настолько сложны и так мало изучены, что простое введение гена в большинстве случаев не вызывает необходимого лечебного эффекта.

Однако при всем этом перспективность генной терапии трудно переоценить. Есть все основания надеяться на то, что прогресс в сфере молекулярной генетики и генно-инженерных технологий приведет к несомненным успехам в лечении заболеваний человека с помощью генов. И, в конце концов, генная терапия по праву займет свое место в практической медицине.

Судя по всему, генная терапия может получить несколько неожиданное применение. По прогнозам ученых, в 2012 г. состоятся Олимпийские игры, где выступят трансгенные суперспортсмены. « ДНК-допинг» даст несомненные преимущества
в развитии силы, выносливости и скорости. Можно не сомневаться, что в условиях жесткой спортивной конкуренции найдутся атлеты, готовые к генетической модификации, даже учитывая возможный риск, связанный с применением новой технологии.