Етапни резултати: 1) Анализ на съдържанието на ламин А и ламин В в ядрената обвивка на клетки, избрани на първия етап от работата на линиите (транс-трансформирани хамстерски фибробласти с различен метастатичен потенциал). Във всички клетъчни линии антителата и към двете ламини ярко оцветяват ядрата. В HET-SR клетките (нискометастатичните) ядра имат правилна форма, ламин А се открива както в ядрената обвивка, така и в нуклеоплазмата, а ламин В е по-ярък, присъства главно в ядрената обвивка. Всички силно метастатични клетъчни линии показват голямо разнообразие от ядрени форми, както и образуване на гънки или неправилни натрупвания на ламини (фиг. 1). В спонтанно трансформирани клетки, при които трансформацията е настъпила в резултат на дългосрочно in vitro култивиране на ембрионалната клетъчна линия на сирийския хамстер (ST-HET-ниско метастатични клетки, ST-HET клон 83/20-високометастатични клетки) се наблюдават подобни промени- при липса на значителна разлика в интензивността на оцветяване на ламини A и B между ниско- и високометастатичните линии, имаше голяма променливост във формата на ядрата във високометастатичната линия ST -HET клонинг 83/20 и неравномерно разпределение на двата ламина (фиг. 2). Western blot анализът на експресията на ламини също не показва значителна разлика в съдържанието на ламини A и B между ниски и високи метастатични клетки (фиг. 3). Тъй като разликите в метастатичната активност in vivo могат да зависят от активността на матричните металопротеази, в изследваните линии беше извършен зимографски анализ. За тази цел клетките се посяват върху 35 mm чаши Петри в концентрация 150 000 клетки на чиния, култивират се за 1 ден, след това се промиват 3 пъти със среда без серум и се оставят в среда без серум за 12 часа и кондиционираната среда се събира . След това броят на клетките в съдовете се преброява, за да се нормализира прилагането на протеин при изследването на активността на металопротеиназите. За да се анализира желатиназната активност на матричните металопротеази, 10 μl аликвоти от кондиционираната среда се смесват с 10 μl буфер за прилагане на протеини за зимография и се зареждат върху гела. Стандартният SDS-PAGE се провежда при стандартни условия в 8% полиакриламиден гел, съдържащ 0,2% желатин, ренатурацията се извършва в продължение на 30 минути и желатиназната реакция се провежда в продължение на 4 часа. За всички изследвани линии е открита активността на металопротеиназа 2, но не са открити значителни разлики в активността на металопротеинази между ниски и високи метастатични клетки (фиг. 4). По този начин разликите в метастатичния потенциал на клетките на сирийския хамстер с различни методи на трансформация не са причинени от промени в съдържанието на ламин А или ламин В, а са свързани с промяна във формата на ядрата и разпределението на ламините, което показва възможно нарушения както при насочване на ламини към вътрешната ядрена мембрана, така и при регулиране на сглобяването на микродомейни на ламина. 2) Анализ на миграционната активност на клетките в ограничено пространство. Миграционната активност на клетките, в зависимост от нивото на експресия на ламин А и неговите варианти на снаждане, се провежда в камери на Бойдън с диаметри на порите 3 и 8 μm. За да се създаде градиент на хемоатрактант, към долната камера се добавя ембрионален серум; клетките в горната камера се инкубират в среда без серум (фиг. 5). Анализът е извършен върху клетъчни популации от линията HT1080 (човешки фибросаркома), хетерогенни по отношение на нивото на експресия на GFP-ламин А и GFP-прогерин, както и клетки с нокдаун на ламин А (нивото на нокдаун в отделни клетки е пропорционален на флуоресценцията на GFP, коекспресиран с РНК на фиби срещу ламин А) ... Анализът на ефективността на миграцията беше извършен на следващия ден след засяване с помощта на високопроизводителен микроскопичен скрининг и автоматично откриване на броя на клетките с надпрагово ниво на GFP сигнал от двете страни на мембраната, използвайки алгоритми, оптимизирани на предишния етап от Проектът. Резултатите от анализа показват, че делът на клетките, експресиращи както екзогенен ламин А, така и прогерин, е значително намален в популацията на клетки, мигрирали през порите, което показва инхибиране на миграцията (Фиг. 6). Този ефект зависи от размера на порите: ефективността на миграцията през 8-μm пори намалява съответно с 25% и 32% за ламин А и прогерин, а при миграция през 3-μm пори ефективността намалява още по-значително-с 61 % и 66%. В същото време потискането на експресията на ламин А не води до активиране на миграцията (фиг. 7). Очевидно, тъй като тези проучвания използват трансформирани клетки с първоначално висок миграционен потенциал и висока пластичност на ядрената обвивка, допълнително намаляване на нивото на ламина А не допринася значително за способността на клетките да мигрират през порите. Следователно, на следващия етап от експериментите се планира да се използват HSR линии, описани в предишния доклад, които демонстрират различни възможности за метастази (инвазия в тъканите на тялото), както и техните трансгенни варианти. 3). За изследване на клетъчната миграция в 3D колагенов гел, оптимизиран алгоритъм за регистрация на изображението чрез плоска осветена микроскопия (SPIM) е разработен съвместно от PhaseView. Този алгоритъм и неговото хардуерно внедряване осигуряват 3D светлинна микроскопия с плоско осветление (SPIM) с лазерен светлинен лист с повишена равномерност и дълбочина на разпространение по цялото зрително поле в средни до големи прозрачни и полупрозрачни проби. По -специално, тази система осигурява средства за поддържане на минималната дебелина на лазерния светлинен лист вътре в обекта при максималната възможна площ за дадена оптична конфигурация, което осигурява еднаква и максимално възможна аксиална разделителна способност по цялото зрително поле. Системата се основава на синхронизирането на скоростта и фазата на ролетката на CMOS камерата, използвана за регистрация на изображението, с движението на седлото на лазерния лист с помощта на адаптивна оптика, инсталирана в оптичния път на възбуждане (фиг. 8). Системата е специално адаптирана за анализ на клетъчната миграция в триизмерен гел, тъй като SPIM микроскопията осигурява намалена фототоксичност и значително по-висока скорост на улавяне на изображението в сравнение с лазерната конфокална микроскопия с сканиране от точка до точка, което позволява дългосрочно интравитално наблюдения, като същевременно се анализира значително по -голям обем на извадката с висока пространствена и времева разделителна способност (фиг. 9). Тази система ще бъде допълнително използвана за анализ на ефекта на инхибирането на Zmpste24 върху миграционната активност на раковите клетки в 3D гелове. 4) Ефектът от експресията на екзогенен ламин А и прогерин върху механичните свойства на ядрената обвивка в живите клетки беше анализиран с помощта на сканираща йонно проводима микроскопия (SICM). Този метод, в допълнение към възможността за високоскоростно сканиране на повърхностния релеф на живи култивирани клетки с висока странична и аксиална разделителна способност, дава възможност за измерване на еластичните свойства на клетките (фиг. 10а, б). Измерването на коефициентите на еластичност на ядрото е възможно и поради тънкия слой цитоплазма над клетъчното ядро, разпръснат върху стъклен субстрат. За да се сведе до минимум приносът на цитоплазмата към определените параметри на ядрото, се използват HT1080 човешки фибросаркомни клетки, показващи висока степен на разпространение. Клетките се трансфектират с плазмид, кодиращ GFP-ламин А или GFP-прогерин. Измерванията бяха извършени на MNT инструмент (Medical Nanotechnology LLC), инсталиран на обърната флуоресцентна платформа Eclipse Ti2 (Nikon) на втория ден след трансфекцията. Като сканиращ елемент се използва стъклена микропипета на пиезоконтролер (фиг. 10, а). Клетките за сканиране се подбират според нивото на флуоресценция в GFP канала. Първо се сканира топографията на изследваната клетка. В този случай повърхността се открива, когато при достигане на нейната граница със стъклена микропипета силата на йонния ток спадне с ~ 0,25-1%. След това беше определена ефективната коравина, изчислена от записаното крайно изместване на мембраната, след като тя беше изтласкана от йонния ток, и беше определена следващата точка на спада на йонния ток с ~ 1%. Цялата клетка беше сканирана, след това позицията на ядрото беше определена в най -високата точка на релефа. В тази област бяха взети 10 точки за обработка, стойността на скованост за още 10 точки беше избрана по периферията на клетката, докато тези точки изобщо не трябва да се намират близо до ръба на цитоплазмата, така че стойностите на твърдостта на субстрата да не попадат в пробата (фиг. 10, в). Резултатите от измерванията на еластичността на ядрото се нормализират до еластичността на цитоплазмата в областта на ламелата. В редица експерименти бяха проведени измервания на фона на разглобяване на цитоскелета на актина и тубулина (под действието на нокодазол и цитохалазин D), степента на разглобяване беше оценена с помощта на имунооцветяване на клетки с антитела срещу бета-тубулин или жизненоважни оцветяване със SIR-актин. Предварителните резултати показват директна връзка между концентрацията на екзогенен GFP-ламин А в ядрото и сковаността на клетъчното ядро ​​(Фиг. 11). Ще продължат изследванията за оптимизиране на метода (избор на капилярен диаметър, модификация на алгоритмите за изчисляване на твърдостта и др.) С цел подобряване на точността на измерване, увеличаване на размера на пробата, а също и за проучване на ефективността на инхибиторите на Zmpste24. 5). Проучването на ефекта на експресията на прогерин върху структурната организация и позиционирането на периферния хетерохроматин е проведено с помощта на модел на клетъчни линии на китайски хамстер (CHO), в генома на който изкуствен хромозомен локус, съдържащ множество тандемни повторения на оператора Lac да бъдат интегрирани. Локусите се визуализират с помощта на клетъчно експресиран GFP-Lac репресор (Robinett et al, 1996). Използвахме клон AO_3, който съдържа усилен изкуствен локус (HSR), показващ висока степен на хетерохроматинизация и трайно свързан с ядрената ламина (Li et al, 1998; Zhironkina et al., 2014). CHO AO_3 клетки бяха трансфектирани с плазмид, кодиращ GFP-прогерин, след 48 часа клетките бяха фиксирани и имунооцветени с антитела срещу ламин А за диференциране на сигналите на GFP-Lac репресор и GFP-прогерин. Имунофлуоресцентната микроскопия и свръхрезолюционната микроскопия показват, че експресията на прогерин не причинява намаляване на степента на уплътняване, оценена чрез промени в HSR областта или средния интензитет на флуоресценцията на GFP в нея (фиг. 12). Също така не са наблюдавани значителни промени в позиционирането на HSR спрямо ядрената обвивка: в клетки с високо ниво на експресия на прогерин, лобуларната структура на ядрото, типична за прогерията на Hutchison-Gilford и образуването на множество инвагинации на ядрената обвивка са разкрити и HSR винаги остава свързан или с ядрената периферия, или с ламини в области на инвагинации. За изследване на ултраструктурната организация на хроматина в клетки, експресиращи GFP-прогерин, беше използвана имуноелектронна микроскопия с антитела срещу GFP, последвана от Ag-усилване на сигнала на вторични белязани с Nanogold антитела. Този подход направи възможно идентифицирането на трансфектирани клетки на светлинно-оптично ниво с помощта на оптична микроскопия с ярко поле и ефективното им намиране на ултратънки разрези. Електронният микроскопски анализ показа, че както изкуствените хромозомни локуси, така и ендогенните хетерохроматични участъци на хромозомите, противно на изложените по -горе хипотези, запазват своята кондензирана структура. В този случай обаче често се наблюдава загуба на връзката на периферния хетерохроматин с ядрената ламина и неговото придвижване във вътрешните области на ядрото (фиг. 13, а). При тези условия значителни участъци от ядрената пластинка остават свободни от контакти с хетерохроматин (фиг. 14). 6). Идентифициране на обхвата на най-обещаващите конкурентни инхибитори с помощта на методи за молекулярно моделиране, по-нататъшно изследване на стабилността на ензимно-инхибиторните комплекси по методите на молекулярната динамика, за да се изберат кандидат-съединения за експериментални изследвания. рекомбинантен човешки ензим и протеин от Saccharomyces cerevisiae Ste24p. В същото време е известна само една структура на комплекса ZMPSTE24 с един от инхибиторите на разтворими цинк-зависими металопротеази, който осигурява слабо конкурентно инхибиране на ZMPSTE24, фосфарамидон, което се характеризира с ниска разделителна способност на кристалографския метод. Въпреки сходството на активното място на ZMPSTE24 с някои цинкозависими металопротеази, като термолизин и неприлизин, свързването на фосфорамидон е осигурено на много по-ниско ниво. Защото експериментите са проведени in vitro, няма преки доказателства за ефективността на този клас инхибитори като лекарства. Очакванията за ефективността на действието in vivo не са подкрепени от никакви методи в момента; освен това доставянето на такива съединения може да бъде възпрепятствано от сложното навлизане в активния център на ZMPSTE24, образувано от интерфейса на ензим-липид -водно взаимодействие, както беше описано от нас по време на предишния етап от работата през 2017 година. От друга страна, беше установено, че клас молекули, използвани в антиретровирусна терапия за пациенти с ХИВ, може да причини липодистрофия при тях в резултат на неподходящо свързване на тези молекули към ZMPSTE24. В същото време лопиновир се оказа най -ефективен, за което експериментално беше показан конкурентният механизъм на инхибиране на ZMPSTE24. Предвид описаните ограничения, използването на класическата схема за скрининг in silico за библиотеки с химически съединения, която по правило представлява изброяване на голям брой произволни или синтезирани в момента структури на органични молекули и последващото им докинг в статичната кристалографска структура на ZMPSTE24, изглежда е неефективна. Структурата на ZMPSTE24 е доста уникална форма, образувана от седем трансмембранни спирали, обграждащи пълна с вода вътрешна кухина с обем от 14 000 кубични антрома, затворени в липиден двуслой. Повечето съвременни програми за докинг използват в своите изчисления изключително имплицитна форма на воден разтвор при изчисляване на енергиите на свързване и не могат да вземат предвид ефекта на липидния двуслой. Използването на статични структури ZMPSTE24, потопени в двуслоен, няма да може да вземе предвид спецификата на джобовете, образувани на границата между ензим-липид-вода, както и техните динамични характеристики-моделът на липидния слой предполага висока подвижност на хидрофобния част от двуслойните молекули в сравнение със структурата на кухините и джобовете.стабилни протеини. Комбинацията от тези фактори води до неефективност на такъв популярен метод за търсене на инхибитори като SAR проучвания (връзка структура-активност), адаптиран към модели на чист воден разтворител. Най -рационалният начин в този случай включва използването на основната структура на молекулите, чийто потенциал вече е показан в експерименти in vitro и in vivo, като отправна точка за търсене на модификации, чието въвеждане ще осигури високо ефективност на свързване. В момента най -добрите кандидати са синтетичните пептидомиметици, използвани при инхибирането на аспартат протеази, вкл. и HIV протеаза. За да търсим механизма на действие на такъв клас молекули, който все още е неизвестен за ZMPSTE24, ние разработихме in silico метод за търсене на места за свързване, както и пътища за доставяне на молекули от разтвора, като се вземат предвид както ензимът- интерфейс липид-вода и много динамичната структура на ензима и околната мембрана. Методът се основава на прилагането на моделиране на молекулярна динамика в комбинация с разширен метод на метадинамика (виж по -долу). Важността на този подход се дължи на факта, че в литературата вече е имало опит да се модифицират структурите на HIV протеазните пептидомиметици, въз основа на хипотезата за общото механистично действие на аспартат протеази и цинк-зависими разтворими протеази. По аналогия механизмът е предложен за ZMPSTE24. В същото време тази хипотеза не е потвърдена от структурни изследвания. В хода на нашето изследване беше открит изцяло нов механизъм на действие на пептидомиметиците на HIV протеази, който отваря редица характеристики и идеи за рационалното проектиране на ефективен инхибитор ZMPSTE24. Разработеният алгоритъм беше приложен за определяне на разпределението на възможните конформационни състояния и видове свързване на лопиновир спрямо цялата повърхност на ZMPSTE24, потопен в липидния двуслой, както и във вътрешната му кухина и на разстояние от повърхността в дебелината на разтвор, както воден, така и липиден. Това даде възможност да се оцени енергийно свързването на лопиновир във всички потенциални места на свързване, както и бариерите между тях и възможните пътища на миграция от външен разтворител. Такива енергийни карти са изградени спрямо три координати на фазовото пространство и са представени под формата на срезове при отделни стойности на една от избраните променливи и изоповърхности (фиг. 1,2). Тези. За интерпретиране на получените многоизмерни енергийни карти е удобно да се използват фиксирани стойности само на една променлива, например разстоянието на центъра на масата на лопиновир от центъра на масата на ензима, но да се начертаят разпределенията спрямо другите две променливи - ъглови θ и φ. Анализът показва, че проникването на лопиновир от воден разтвор в мембраната е трудно поради наличието на бариера. Тази бариера се образува в резултат на структурните особености на липидния двуслой: заредените части на фосфолипидите, съставляващи мембраната - фосфатидилхолин и фосфатидилетаноламин - са ориентирани към водния разтвор, образувайки диполен повърхностен потенциал, който в началния етап на преминаването на лопиновир в мембраната осигурява бариера, както стерична, така и евентуално ентропична, наблюдавана в липидно-водни системи. Защото Лопинавир е хидрофобно съединение, навлизането му в липидния слой е полезен процес сам по себе си. Въпреки това, начинът на неговата концентрация в мембраните преминава през бариерата, образувана от повърхностния диполен потенциал. В същото време е възможно да се наблюдава, че проникването на лопинавир в мебрана е енергийно по -благоприятно в диапазона от стойности 60<θ<75 и -160<φ<-180. Эта область соответствует границе липидной мембраны с водным раствором над входом во внутреннюю полость ZMPSTE24, используемым белковым субстратом для проведения каталитического протеолиза. Детальное исследование этой области в процессе молекулярной динамики позволило выявить проседание липидного бислоя вблизи входа в активный центр фермента относительно общей поверхности мембраны (Рис.3). Подобное проседание обеспечивается специфическим распределением заряда на поверхности ZMPSTE24, показанное в ходе одного из этапов работы в 2017г. По всей видимости, мы предполагаем, что проседание формирует разрыв в дипольной части бислоя и облегчает доступ гидрофобных молекул к внутренней гидрофобной части мембраны. Однако, при этом, наименьшим значением энергии соответствует связывание лопинавира на интерфейсе, образованным входом в активный центр фермента и липидным бислоем (75<θ<100 и -160<φ<-180,160<φ<180). Несмотря на возможность проникновения лопиновира во внутреннюю полость фермента, специфического взаимодействия с остатками каталитического центра или областью связывания субстрата обнаружено не было (Рис. 1). Косвенно эти результаты подтверждаются отсутствием кристаллографической структуры ZMPSTE24 в комплексе с лопинавиром в активном центре. Обнаруженный нами механизм связывания также подтверждает и ингибирование лопинавиром фермента по конкурентному типу. Мы также провели подобное исследование в системе фермент-вода без липидного слоя. Подобного типа связывания обнаружено не было (Рис. 2). Это может объяснить отсутствие электронной плотности лопинавира в кристаллах ZMPSTE24, выращенных при добавлении ингибитора, ввиду отсутствия в кристаллах упорядоченной структуры мембраны. Для установления специфических взаимодействий лопинавира в процессе связывания на входе в активный центр мы провели кластерный анализ ансамбля структур ингибитора, обнаруженных в процессе его нахождения в обнаруженном нами центре связывания. Для этого был использован непараметрический байесовский метод кластеризации по основным двугранным углам, определяющим конформацию лопинавира (см. ниже). На предмет специфических взаимодействий был использован самый населенный кластер. Ориентация и конформация лопинавира характеризуется стэкинг-взаимодействием одной из боковых фенильных групп с фениаланиновым аминокислотным остатком фермента, обеспечивающих структуру петли на входе в активный центр, плотным контактном гидрофобных групп аминокислот образующих вход спиралей фермента с боковыми гидрофобными группами лопинавира. Также гидрофобные группировки лопинавира частично остаются в липидном бислое. Кетотетрагидропиримидиновая группировка лопинавира – наиболее полярная часть ингибитора – обращена во внутренню полость фермента, наполненную молекулами воды. Таким образом, мы предлагаем данный центр связывания, как наиболее перспективный с точки зрения связывания конкурентных ингибиторов пептидомиметиков, ввиду наличия как функционально важных заряженных и гидрофобных групп фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, так и особым способом доставки и проникновения в мембрану. В метадинамике к основному потенциалу системы добавляется смещающий гауссов потенциал от коллективных переменных через определенные промежутки времени (формула 1). Высота ω и ширина δs гауссова потенциала и частота τG добавления этого смещающего потенциала к полному потенциалу системы, а также выбор коллективных переменных (CV) являются важнейшими параметрами при таком моделировании. Для построения полной трехмерной карты свободной энергии лопинавира при движении относительно ZMPSTE24 мы должны были подобрать такие CV, который бы описывал этот процесс наиболее точно. Каждую точку на поверхности белка в системе координат связанной с центром масс белка можно задать тремя переменными: два сферических угла θ и φ и расстояние между центром масс белка и лиганда r (Рис. 4). ZMPSTE24 представляет собой мембранный белок, содержащий структуру из трансмембранных альфа-спиралей, образующих камеру внутри белка существенного объем. Поэтому выбор именно таких трех коллективных переменных позволяет исследовать внешнюю и внутреннюю поверхности белка, а также процесс проникновения лопинавира в камеру внутри фермента. Таким образом положение лиганда относительно центра масс белка описывалось обычными сферическими координатами, которые легко перерассчитывались из декартовых компонент радиус-вектора между белком и лигандом (формула 2). Значение ω для потенциала смещения равнялось 5 кДж/моль, ширина потенциалов δsθ и δsφ выбраны 0.1 радиан и 1Å для δsr. Такой выбор этих параметров позволил плавно исследовать всю поверхность свободной энергии. При движение лопинавира от одной точки поверхности белка к другой может быть энергетически выгодно его смещение в раствор. Однако отдаление на значительное расстояние может, с одной стороны, замедлить расчеты, а с другой внести артефакты, связанные с сильным изменением радиуса. Чтобы избежать сильного удаления лопиновира от белка было введено ограничение на координационное число. Координационное число позволяет количественно охарактеризовать степень близости лиганда к белку и рассчитывается по формуле 3. Само число состоит из слагаемых sij, которые равняются 1, если атом j, в данном случае, лиганда расположен не дальше, чем на расстоянии r0 от атома белка i (то есть образует «контакт»), и в любом другом случае равно нулю. Введения ограничения на координационное число позволяет, варьируя параметр r0, контролировать расстояние, на которое ингибитор может отходить от поверхности белка. Параметры для ограничения системы по координационному числу были подобраны в ходе ряда калибровочных запусков метадинамики таким образом, чтобы лиганд имел возможность отходить от белка на расстояние, на котором между ними может оказать растворитель, но при этом достаточно малое, чтобы в случае можно было почувствовать взаимодействие с поверхностью. При сильном отдалении лопиновира от белка средства программы для метадинамики вводят дополнительную энергию таким образом, чтобы сблизить их друг с другом. Это, без дополнительного контроля, может привести к тому, что белок может начать разрушаться. Так происходит потому, что при удалении ингибитора все меньше атомов белка будут находиться в контакте с ингибитором (Рис. 5), а это, в свою очередь, приведет к тому, что системе может оказаться более выгодным начать разрушение белка вместо того, чтобы двигать лиганд в сторону поверхности. Для предотвращения такого исхода дополнительно было введено ограничение значение RMSD всех атомов основной цепи белка. Такой выбор атомов для RMSD позволил предотвратить разрушение структуры фермента, но также не стал препятствием для свободного движения аминокислотных радикалов, которое может происходить в растворе, при взаимодействии с мембраной, а также при взаимодействии с ингибитором. Молекула лопинавира не является стандартной для атомных силовых полей. Точечные заряды на атомах были рассчитаны с применением процедуры RESP. Однако, лопинавир – достаточно большая молекула, поэтому для расчета зарядов он был логично разделен на три части, которые были параметризованы по отдельности (Рис. 6). Такой подход позволил избежать возможных артефактов при расчете заряда, в связи с наличием большего количества конформеров лопинавира. Кроме того, при дальнейшем поиске новых ингибиторов на основе лопинавира, можно будет легко заменять одну или две части молекулы, используя уже известные параметры для остальных константных частей. Параметры силового поля для атомов были выбраны в соответствии с атомным силовым полем GAFF (General Amber Force Field). Молекулярно механическая энергия итоговой молекулы была сопоставлена с квантовой энергией. Сравнение показало, что молекулярно механическая модель, рассчитанные точечные заряды и выбранные параметры поля с высокой степенью точности совпадает с квантовой. Кластеризацию цельной структуры субстрата проводили на базе значений дигедральных углов между углеводными мономерами, с использованием следующей модификации: Отображение фазового пространства углов – в общем случае L-мерного бокса Pc (формула 4). Продуктом отображения является тор Te – L-мерная поверхность на единичной сфере S2L-1. Отображение является локальной изометрией с сохранением меры расстояний. Преобразованные переменные использовали для кластеризации с помощью Байесовского непараметрического метода, имплементированного в программе dpMMlowVar. Оптимизацию углового параметра для данного метода проводили в пределах [-0.6;-0.3] с шагом 0.01 на основании оценочной функции силуэт. При визуализации результатов кластеризации использовали метод главных компонент для трансформированных значений углов с выделением первых трех главных компонент.

Въведение... През последните години, във връзка с напредъка в молекулярната генетика, довел до картографиране и идентифициране на гени на значителен брой моногенни наследствени заболявания, започнаха да възникват трудности при създаването на тяхната класификационна структура. Например, мутациите в един и същ ген могат да доведат до проява на различна тежест на клиничните форми на едно и също заболяване (алелна хетерогенност) и до появата на нозологични форми на различни клинични прояви (т.нар. "Алелни серии"). Една от групите заболявания, които съставляват алелната серия, са ламинопатиите. Те са причинени от мутации в LMNA гена, водещи до промяна в структурата и функцията на ламина A / C протеина (ламинопатиите са заболявания, които се развиват в резултат на мутации в гените на ядрените ламина протеини - виж по -долу).

Известно е, че мембраната на клетъчните ядра включва три основни компонента (виж фигурата): [ 1 ] външна мембрана, [ 2 ] вътрешна мембрана и [ 3 ] тънка ядрена ламина, лежаща под нея - ядрена ламина (ламина: лат. - lamina), образувана от протеинови комплекси, които включват различни групи ламини (ламина протеини - виж по -долу). Ламиновите нишки образуват успоредни суперспирирани димери, които, полимеризирайки, образуват влакнеста мрежа от нуклеоплазмената страна на вътрешната ядрена мембрана, служейки като котва за мултипротеинови комплекси както на вътрешната, така и на външната ядрена мембрана (бележка: ламините принадлежат към 5 -ти клас междинни влакна, присъстващи във всички еукариотни клетки, т.е. във всички клетки с образувано ядро).

По този начин ламините са структурни протеини (с маса 60 - 89 kDa), компоненти на ядрена ламина - протеинова мрежа, която се намира под вътрешната мембрана на ядрото и определя нейния размер и форма (т.е. участва в механичната адхезия и взаимодействие на протеини на нуклеоскелета и цитоскелета). Ядрената ламина осигурява здравината на ядрената обвивка и организацията на ядрените пори, издържа на силите на деформация и предпазва хроматина от физически повреди. Както показват последните проучвания, наред със структурната функция, ламините участват в контрола на репликацията на ДНК, организацията на хроматина и в регулирането на генната експресия, обработка и апоптоза.

Както бе споменато по-горе, ядрената ламина се състои от четири ламина протеина: A, B1, B2 и C. Ламини B1, B2 (наричани още ламини от тип B) са кодирани от два гена, LMNB1 и LMNB2 (локализирани върху хромозоми 5q23 и 19q13, съответно) и се синтезират във всички клетки на многоклетъчни животни. Ламини A и C (така наречените ламини A-тип [или ламини A / C]) са продукти на алтернативно сплайсинг на един LMNA ген (разположен на първата хромозома 1q21.2-q21.3 и състоящ се от 12 екзона) и се намират в сравними количества в диференцирани тъкани на всички гръбначни животни, вкл. човек.

прочети и поста: Номенклатура на човешки хромозоми(към уебсайта)

Забележка! Последните проучвания дават основание да се разглеждат ламините като един от основните протеини, които осигуряват синхронизиране на разпадането и възстановяването на ядрената мембрана в процеса на клетъчно делене. Доказано е, че фосфорилирането на ламини се случва в профазата на клетъчното делене, което води до тяхното разпадане, което е сигнал за разрушаване на ядрената обвивка. Обратно, в телофазата настъпва дефосфорилиране на ламини, което води до тяхното агрегиране. Смята се, че процесът на реполяризация на ламините стимулира възстановяването на ядрената обвивка. Това се доказва от данните, че в профазата на клетъчния цикъл се запазва връзката на ламините с фрагментите на разградената ядрена мембрана и те са своеобразен „етикет“ за фрагментите от ядрената обвивка по време на нейното възстановяване.

По този начин основните функции на ламините са: [ 1 ] 1 ключова роля за поддържане на формата и целостта на ядрената обвивка; [ 2 ] организацията на хроматина и разпределението на ядрените пори; [ 3 ] пространствената организация на процесите на репликация и транскрипция на ДНК, митотични събития и апоптоза; [ 4 ] участие в различни сигнални пътища; [ 5 ] организация на генома.

Мутациите в гена LMNA са отговорни за развитието на повече от дузина заболявания, наречени ламинопатии, засягащи различни тъкани както поотделно (скелетни мускули и миокард, мастна тъкан, периферни нерви), така и системно (синдром на преждевременно стареене). Отбелязват се и припокриващи се фенотипове. Наред с широката клинична вариабилност, характерна е и изразената генетична хетерогенност.

Забележка! Към днешна дата е доказано, че мутациите в гена LMNA (кодиращи ламини от тип А [ламин A / C]) са етиологичният фактор 11 ( ! ) независими нозологични форми, които са част от пет групи наследствени заболявания - прогресивни мускулни дистрофии, разширени кардиомиопатии, липодистрофии, наследствени двигателно -сензорни невропатии и синдроми на преждевременно стареене. Най -често мутациите в гена LMNA водят до увреждане на скелетните мускули, миокарда и мастната тъкан, много по -рядко те са етиологичният фактор за прогероидни синдроми, наследствени невропатии и летална рестриктивна дермопатия. В същото време горните синдроми могат да бъдат причинени от мутации както в гените на самите ламини, така и в гените на партньорските протеини (SREBP1, emerins) и ензимите, участващи в обработката на ламините.

бележка: MD ED - Emery -Dreyfuss мускулна дистрофия; KP MD - мускулна дистрофия на крайника и пояса; MD - мускулна дистрофия; DCM - разширена кардиомиопатия; KMP - кардиомиопатия; AD - автозомно доминантно наследяване; AR - автозомно рецесивно наследяване

Точният механизъм на развитие на ламин-свързани заболявания все още не е проучен подробно. Две основни хипотези, които обясняват наблюдаваните патологични фенотипове, доминират: структурната хипотеза и хипотезата „генна експресия“. Според първия, липсата на ламини или неправилното сглобяване на мутантните ламина протеини води до намаляване на силата на ядрената ламина и увеличаване на уязвимостта на ядрото и клетката като цяло. На първо място, клетките, които са подложени на механичен стрес, като мускулни клетки и кардиомиоцити, страдат от развитието на дегенеративни промени. Втората хипотеза предполага нарушение на връзката между ядрената ламина и транскрипционните фактори. Наскоро беше формулирана друга хипотеза, според която мутацията на A / C ламини или липсата на ламини от A -тип може да провокира трети механизъм на патогенезата - временно разкомплектоване (поради нарушение на целостта на ядрената мембрана), водещо до неадекватно обмен между ядрени и цитоплазмени компоненти.

Повече за свързаните с ламина заболявания в следните източници:

статия "Клинични и генетични характеристики на наследствени ламинопатии" E.L. Дадали, Д.С. Билева, И. В. Угаров; Медицински генетичен научен център на Руската академия на медицинските науки, Москва; Катедра по генетика, Медицински и биологичен факултет, Руски държавен медицински университет, Москва (списание "Анали на клиничната и експериментална неврология" № 4, 2008 г.) [прочетете];

статия "Мутации на ламина A / C гена (LMNA) при пациенти с дилатативна кардиомиопатия и техните фенотипни прояви" Вайханская Т.Г., Сивицкая Л.Н., Даниленко Н.Г., Курушко Т.В., Давиденко О.Г .; Републикански научно -практически център "Кардиология", функционална група по клинична патофизиология на кръвообращението, Минск, Беларус; Държавна научна институция "Институт по генетика и цитология", Национална академия на науките, лаборатория по нехромозомна наследственост, Минск, Беларус (Eurasian Journal of Cardiology, No. 1, 2016) [прочетете];

дисертация за степен кандидат на медицинските науки "Клинично и генетично разнообразие и молекулярна диагностика на мускулната дистрофия на Емери-Дрейфус" Адян Таги Аветиковна, Федерална държавна бюджетна научна институция "Медицински генетичен изследователски център", Москва, 2015 г. [прочети];

презентация "Прогерия - синдром на прогерия на Хътчинсън -Гилфорд (HGPS)" С. Кокорин, Е. Подхалюзина, В. Смирнов; Семинар по молекулярна биология; 25.12.2010 г. (bioinformaticsinstitute.ru) [прочетете];

статия "Фамилна частична липодистрофия (синдром на Дъниган) поради мутация в гена LMNA: първото описание на клиничен случай в Русия" Соркина, М.Ф. Калашников, Г.А. Мелниченко, А.Н. Лалета; Катедра по ендокринология, Факултет по обща медицина, ТЕ. Сеченов, Министерство на здравеопазването на Русия, Москва; ФГБУ "Ендокринологичен изследователски център" на Министерството на здравеопазването на Русия, Москва (списание "Терапевтичен архив" № 3, 2015 г.) [прочетете]

© Laesus De Liro

Нарушаването на Договора за ядрените сили със среден и малък обсег (Договор за INF) ще увеличи риска от ядрен конфликт, каза Сергей Лавров. Според външния министър Русия ще отговори на оттеглянето на САЩ от споразумението с военно-технически средства

Сергей Лавров (Снимка: Владимир Астапкович / РИА Новости)

Говорейки в университет в столицата на Киргизстан, шефът на руското външно министерство коментира решението на Вашингтон да започне оттегляне от Договора за INF, предаде РИА Новости. Според министъра говорим за настъпването на нова ера, когато САЩ „поеха курс за унищожаване на цялата система за контрол на оръжията“.

Лавров спомена и плановете на САЩ за създаване на ядрено оръжие с нисък добив. Според него всичко това ще понижи прага за използване на ядрени оръжия и ще увеличи риска от конфликт.

Руският министър предположи, че резултатът от случилото се ще бъде развитието на Студената война и надпревара във въоръжаването. Москва обаче ще отговори на възникващите заплахи с "военно-технически средства".

Що се отнася до перспективите за руско-американски диалог за стратегическата стабилност, Лавров изрази надеждата, че „САЩ ще узреят, за да разберат своята отговорност за проблемите, поставени от политиката им. „Тогава сте добре дошли, вратите са отворени, ще говорим при равни условия, като вземаме предвид законните интереси един на друг, а не фиктивни“, каза министърът.

Русия отговори на действията на американските власти. Президентът Владимир Путин обяви прекратяване на участието в споразумението на среща с Лавров и министъра на отбраната Сергей Шойгу. В същото време държавният глава подчерта, че Русия няма намерение да се включва в надпревара във въоръжаването, която струва скъпо за Москва.

Причината за решението на САЩ беше руската крилата ракета 9М729, която се изстрелва с пускови установки „Искандер-М“. Американските власти поискаха да спрат разработването на тази ракета, обвинявайки Русия в нарушение на Договора за INF. Москва отрича тези обвинения. Сергей Лавров заяви, че американската страна е започнала да нарушава договора през 1999 г., когато Съединените щати започнаха да тестват бойни безпилотни летателни апарати.

Договорът за ядрените сили със среден и малък обсег е подписан между САЩ и СССР през 1987 г. Той забранява изпитването, производството и пускането в експлоатация наземни ракети с по-малък (от 500 до 1000 км) и среден обсег (от 1000 до 5,5 хиляди км). Страните също се ангажираха да унищожат такива ракетни системи, които вече са в експлоатация в рамките на три години след подписването на Договора за INF. Оттеглянето от договора дава възможност да се върнем към разработването и производството на такива оръжия.

Ядрената ламина се състои от междинни нишковидни протеини, наречени ламина
Ядрената пластинка се намира зад вътрешната ядрена мембрана и е физически свързана с нея чрез интегрални мембранни протеини
Ядрената ламина участва в сглобяването на ядрената обвивка и може да изпълнява функциите на нейната физическа опора
Ядрената ламина се свързва с хроматин чрез протеини. Това може да определи ролята му в репликацията и транскрипцията на ДНК.
Дрождите и някои други едноклетъчни еукариоти нямат ядрена пластинка

Наличието на мрежа от междинни нишки, разположени зад вътрешната ядрена мембрана, е характерна черта на ядрото на клетките Metazoa. Както е показано на фигурата по -долу, ламината се открива лесно чрез непряка имунофлуоресценция, като се използват антитела към един от протеините, които съставляват нейния състав.

В електронен микроскоп ламинприлича на мрежа от отделни влакна. Фигурата показва и типични разстройства на ламиналните нишки, разположени точно зад вътрешната ядрена мембрана.

Протеин ядрена ламина(наречени ламини) приличат на кератиновите протеини на междинните нишки на цитоплазмата. Точно като кератините, те се наричат ​​междинни нишковидни протеини, тъй като образуваните нишки (10-20 nm) са с междинен размер между актинови микрофиламенти (7 nm) и микротубули (25 nm). Целостта на ламиналните нишки се нарушава от YPC, които са прикрепени към него.

Заедно с протеини от междинни влакна, ядрена ламинасъщо така съдържа набор от интегрални мембранни протеини, наречени протеини, свързани с ламина (LAPs). Някои от тези протеини участват във взаимодействието между ламината и вътрешната мембрана на ядрото. Както е показано на фигурата по -долу, ламината е закотвена към вътрешната ядрена мембрана чрез два вида връзки. Един вид се образува между протеините на ламината и интегралните протеини на вътрешната мембрана на ядрото.Друг тип възниква от взаимодействието на полипептидната верига от ламини с липидната фарнезилова група на вътрешната ядрена мембрана.

За да се визуализира ядрената ламина с помощта на флуоресцентна микроскопия, бяха използвани антитела към ламина протеини (в кутия).
Снимката, направена с електронен микроскоп, показва ядрените кошници на ядрени порови комплекси (NPC) и нишките на ядрената пластинка.

Геномът на растението не съдържа ядрени ламина гениобаче растенията съдържат други структурни протеини, които изпълняват същите функции като ламинатите от клетки на бозайници. Дрождите (S. cerevisiae и S. pombe) и някои други едноклетъчни еукариоти не съдържат ламини и следователно не образуват ламини. С какво може да се свърже?

Има поне две възможни причиниобяснявайки отсъствието на ламина при едноклетъчни организми с разликата в размера на ядрата в клетките на дрождите (с диаметър около 1 μm) и многоклетъчните организми (с диаметър около 10 μm). Първата възможност е, че дрождовите клетки се характеризират със затворена митоза, при която ядрената мембрана остава непокътната през цялото време. Обратно, в клетките на многоклетъчните еукариоти ядрената обвивка се разрушава в началото на митозата. След отделяне на хромозоми, около всеки набор от хромозоми се образува нова ядрена обвивка. Смята се, че по това време ламината играе важна роля в преструктурирането на организацията на ядрото.

Второ, ламината може да осигури допълнителна структурна опора за по -голямата ядрена обвивка в клетките на Metazoa.

Наред с ролята, която ядрена ламинаизпълнява при сглобяването и поддържането на структурата на ядрото, неговото взаимодействие с хроматин може да изглежда необходимо за хода на репликацията на ДНК. Доказателства за ролята на ядрената ламина в репликацията са получени в експерименти, при които хроматин от сперматозоиди на Xenopus laevis е добавен към яйчни екстракти. В същото време около хроматина се отбелязва образуването на ядрена обвивка.

Тези ядра се увеличиха по размер и настъпи декондензация. хромозомикоито са били в ядрата на сперматозоидите в кондензирано състояние (декондензацията маскира картината, която се наблюдава по време на оплождането, когато ДНК на спермата взаимодейства с определени фактори в ооцитите). Тогава в тези ядра се извършва репликация на ДНК. Ядрените ламини и LAP са в изобилие в яйчни екстракти.

След отстраняване на ламина от тези екстракти с имобилизиран антителаза ламина протеините все още е възможно образуването на ядрена обвивка около хроматина на спермата. Ядрата обаче са малки и крехки и в тях не се случва репликация на ДНК. Тези резултати предполагат, че ламината може да играе важна роля в организацията на хроматина и репликацията на ДНК.

Увеличено крехкостта на клетките е свързана с мутациизасягащи протеини на междинни нишки. Мутациите в ламините и LAP са отговорни за развитието на редица генетични заболявания, особено тези, засягащи мускулната система. Тези заболявания се наричат ​​ламинопатии. Промените в ламината изглежда правят ядрото крехко и по -податливо на увреждане. Мускулните клетки са особено податливи на увреждане, тъй като по време на мускулната контракция ядрата на техните клетки изпитват по -голям механичен стрес от ядрата на клетките на други тъкани.

Ядрената ламина е свързана с вътрешната ядрена мембрана чрез два вида връзки. Когато плазмената мембрана на сперматозоидите на Xenopus laevis се отстрани и инкубира с яйчен екстракт,
настъпва декондензация на хроматин и около него се образува функционално активна ядрена обвивка.
Флуоресценцията открива локализацията на ДНК.

Ядрената ламина (ядрена ламина) е твърда фибриларна протеинова мрежа, образувана от ламининови протеини (междинни нишки), които стоят в основата на ядрената мембрана, поддържайки я. Това е влакнест слой от ядрената обвивка с порести комплекси. Той е свързан с интегрални протеини чрез слой, състоящ се от преплетени междинни нишки (ламини), които образуват кариоскелет. Нишки от хромозомна ДНК са прикрепени към ламината, т.е. участва в организирането на хроматин. Протеините на порните комплекси са структурно свързани с протеините на ядрената пластинка, която участва в тяхната организация. По този начин, ламина играе много важна роля за поддържане на формата на ядрото, подредено опаковане на хроматин, структурна организация на поревите комплекси и образуване на кариолема по време на клетъчното делене (разпадане на ядрената обвивка в профаза и интегриране в телофаза).

75. Хроматин. Хроматин - малки зърна и бучки, който се намира в ядрото на клетките и възприема добре багрилото (хромос), откъдето идва и името му. Химически, хроматинът се състои от комплекс от ДНК и протеин (който включва и РНК) и съответства на хромозоми, които са представени от тънки нишки в междуфазното ядро ​​и са неразличими като отделни структури. Хроматинът е вещество на хромозомите. Хроматинът се състои от хроматинови фибрили, които могат да бъдат свободно или компактно разположени в ядрото. На тази основа се разграничават два вида хроматин: еухроматин - хлабав или декондензиран (деспирализиран) хроматин, слабо оцветен с основни багрила и не се вижда под светлинен микроскоп, той е достъпен за транскрипция; хетерохроматин - компактен или кондензиран (спирализиран) хроматин, оцветява се добре със същите багрила и се вижда под светлинен микроскоп. Когато клетката се подготвя за делене (интерфаза), хроматиновите фибрили се спирализират в ядрото и хроматинът се трансформира в хромозоми. След разделяне в ядрата на дъщерни клетки, хроматиновите фибрили се деспирализират и хромозомите отново се превръщат в хроматин. Следователно хроматинът и хромозомите са различни фази на едно и също вещество. По този начин според морфологичните характеристики на ядрото (чрез съотношението на съдържанието на еу- и хетерохроматин) е възможно да се оцени активността на транскрипционните процеси (синтетична функция на клетката). С увеличаването му това съотношение се променя в в полза на еухроматин и обратно. При пълно потискане на функцията на ядрото (например в увредени и умиращи клетки, с кератинизация на епитела), той намалява по размер, съдържа само хетерохроматин и се оцветява с основни багрила интензивно и равномерно. Това явление е кариопикноза. Разпределението на хетерохроматина и съотношението на съдържанието на еу- и хетерохроматин са характерни за всеки тип клетки, което позволява тяхната идентификация. В същото време има общи закономерности в разпределението на хетерохроматина в ядрото: неговите клъстери са разположени под кариолемата, прекъсвайки се в областта на порите (поради връзката му с ламината) и около ядрото. По -малките бучки са разпръснати по сърцевината. Тялото на бара е натрупване на хетерохроматин, съответстващ на една Х хромозома при жените, което е усукано и неактивно по време на интерфазата. В повечето клетки той се намира в кариолемата, а в кръвните гранулоцити прилича на малък допълнителен лоб на ядрото („бутче“). Бар телца (обикновено в епителните клетки на устната лигавица) се използват като диагностичен тест за определяне на генетичния пол.

76. Дифузен и кондензиран хроматин (еу- и хетерохроматин).

Хроматин - малки зърна и бучки, който се намира в ядрото на клетките и възприема добре багрилото (хромос), откъдето идва и името му. Химически, хроматинът се състои от комплекс от ДНК, РНК и протеин, където ДНК е в различна степен на кондензация, и съответства на хромозоми, които са представени от тънки нишки в междуфазното ядро ​​и са неразличими като отделни структури. Хроматинът е вещество на хромозомите. Хроматинът се състои от хроматинови фибрили, които могат да бъдат свободно или компактно разположени в ядрото. На тази основа се разграничават два вида хроматин: еухроматин - хлабав или декондензиран (деспирализиран) хроматин, слабо оцветен с основни багрила и не се вижда под светлинен микроскоп, той е достъпен за транскрипция; хетерохроматинът е компактен или кондензиран (спирализиран) хроматин, който се оцветява добре със същите багрила и се вижда под светлинен микроскоп. Когато клетката се подготвя за делене (интерфаза), хроматиновите фибрили се спирализират в ядрото и хроматинът се превръща в хромозоми. След разделянето в ядрата на дъщерните клетки, хроматиновите фибрили се деспирализират и хромозомите отново се превръщат в хроматин. Следователно хроматинът и хромозомите са различни фази на едно и също вещество. По този начин според морфологичните характеристики на ядрото (чрез съотношението на съдържанието на еу- и хетерохроматин) е възможно да се оцени активността на транскрипционните процеси (синтетична функция на клетката). С увеличаването му това съотношение се променя в в полза на еухроматин и обратно. При пълно потискане на функцията на ядрото (например в увредени и умиращи клетки, с кератинизация на епитела), той намалява по размер, съдържа само хетерохроматин и се оцветява с основни багрила интензивно и равномерно. Това явление е кариопикноза. Разпределението на хетерохроматина и съотношението на съдържанието на еу- и хетерохроматин са характерни за всеки тип клетки, което позволява тяхната идентификация. В същото време съществуват общи модели на разпределение на хетерохроматина в ядрото: неговите клъстери са разположени под кариолемата, прекъсвайки се в поревата област (поради връзката му с ламината) и около ядрото (перинуклеарно). По -малките бучки са разпръснати по ядрото. Тялото на бара е натрупване на хетерохроматин, съответстващ на една Х -хромозома при жените, което е усукано и неактивно по време на интерфазата. В повечето клетки той лежи при кариолемата, а в кръвните гранулоцити прилича на малък допълнителен дял от ядрото („бутче“). Бар телца (обикновено в епителните клетки на устната лигавица) се използват като диагностичен тест за определяне на генетичния пол.